Chapter 3 Protein: Primary Structure

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Chapter 3 Protein: Primary Structure. 2010.9.3. Proteins: polymers of amino acids. amino acids. peptides. protein. 单体蛋白质 (monomeric protein) 寡聚蛋白质 (oligomeric protein) 多聚蛋白质 (multimeric protein) 亚基 (subunit). Formation of Peptide. peptide bond. 肽键(酰胺键).
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Chapter 3Protein: Primary Structure2010.9.3Proteins: polymers of amino acidsamino acidspeptidesprotein单体蛋白质(monomeric protein)寡聚蛋白质(oligomeric protein)多聚蛋白质(multimeric protein)亚基 (subunit)Formation of Peptidepeptide bond肽键(酰胺键)肽键是由一个氨基酸的a-羧基和另一个氨基酸(含侧链)的a-氨基除去一分子水缩合而形成。肽键是由一个氨基酸的a-羧基和另一个氨基酸(含侧链)的a-氨基除去一分子水缩合而形成。肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。两分子氨基酸缩合形成二肽(dipeptide),三分子氨基酸缩合则形成三肽(tripeptide)……由二十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide),由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全,被称为氨基酸残基(residue)。多肽链有方向性:S–G–Y–A–LN末端C末端serylglycyltyrosylalanylleucine, orSer–Gly–Tyr–Ala–LeuN 末端:多肽链中有游离α-氨基的一端C 末端:多肽链中有游离α-羧基的一端多肽链的主链(backbone) ——N —— Ca —— C —— 肽基(peptide group)或肽单位(peptide unit) ——CO ——NH —— 蛋白质分子量的估算:20种氨基酸的平均分子量为138但多数蛋白质中,较小的氨基酸占优势,统计结果为氨基酸的平均分子量接近128,减去一分子水(Mr 18) ,因此氨基酸残基的平均分子量为110蛋白质分子量=氨基酸残基数X110肽平面(peptide plane)体内存在多种重要的生物活性肽谷胱甘肽(glutathione, GSH) 蛋白质的分子结构包括:一级结构(primary structure)二级结构(secondary structure)三级结构(tertiary structure)四级结构(quaternary structure) The primary structure is the amino acid sequence (including the locations of disulfide bonds). 1º: 多肽链的氨基酸顺序
  • The secondary structure refers to the regular, recurring arrangements of adjacent residues resulting mainly from hydrogen bonding between backbone groups, with a-helices and b-pleated sheets as the two most common ones.
  • 2º: 多肽链按氢键排列成有规律的a螺旋和b折叠片段The tertiary structure refers to the spatial relationship among all amino acid residues in a polypeptide chain, that is, the complete three-dimensional structure.3º: 多肽链借助各种非共价键弯曲折叠而形成在空间上的相互关系, 一般球状构象(最低的表面积/体积之比,使蛋白质和周末环境的相互作用力最小)
  • The quaternary structure refers to the spatial arrangements of each subunit in a multisubunit protein, including nature of their contact.
  • 4º: 多亚基的蛋白,各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式蛋白质序列的测定
  • 确定蛋白质中不同肽链的数目----末端分析
  • 拆分多肽链
  • 断裂多肽链内的二硫键
  • 分析多肽链的氨基酸组成
  • 确定多肽链N-末端或C-末端残基
  • 裂解多肽链成为较小的片断
  • 测定各多肽段的氨基酸序列
  • 重建完整多肽链的氨基酸序列
  • 确定二硫键的位置
  • 蛋白质测序的常用方法(一)末端分析(一)末端分析N-末端N-末端Frederick Sanger, 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene(1- 氟-2,4-硝基苯)(一)末端分析C-末端羧肽酶(carboxypeptidase): 从C-末端逐一降解肽链,释放氨基酸(二)二硫键的断裂过甲酸氧化或DTT还原(三)氨基酸组成分析 多肽链完全水解后分离游离氨基酸(四)多肽链的部分裂解:酶水解
  • Trypsin(胰蛋白酶):Arg、Lys羧基端肽键;
  • Chymotrypsin(胰凝乳蛋白酶, 糜蛋白酶): Phe、Tyr、Trp羧基端肽键,pH8~9
  • Pepsin (胃蛋白酶):专一性和Chymotrypsin相似,但断裂的是氨基端肽键, pH2
  • Staphylococcus aureus Vs protease (葡萄球菌蛋白酶):Glu、Asp羧基端肽键
  • (四)多肽链的部分裂解:化学裂解
  • Cyanogen bromide (溴化氰,CNBr):Met羧基端肽键
  • 多肽链必须用至少2种试剂裂解,以得到可以重叠的肽段(五)肽段氨基酸序列的测定:Edman化学降解法phenylisothiocyanate(苯异硫氰酸酯,PITC)Disulfide bonds(二硫键)位置的确定胃蛋白酶水解 一向电泳 过甲酸氧化 二向电泳Diagnoal electrophoresis(对角线电泳)通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列分离编码蛋白质的基因测定DNA序列排列出mRNA序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列肽链的化学合成
  • 化学合成肽链是由C-端向N-端延长的,和生物体内合成顺序相反
  • 氨基基团被BOC或Fmoc所保护,保护剂可以用过氟乙酸除去
  • 肽键是由接肽缩合剂DCC使一个羧基被保护的和一个氨基被保护的两个氨基酸脱水形成,DCC转变成不溶物被除去
  • 肽键形成后,洗去未反应的游离氨基酸,N-端去保护,加入需要接入的下一个氨基酸,重复接肽反应
  • 少于150个氨基酸残基组成的肽链可以用固相肽合成仪(solid-phase peptide synthesizer)自动合成
  • 用合成仪合成100个氨基酸残基组成的肽链需要耗时4天,但生物体合成同样的肽只需要5秒且精度更高!
  • 完成肽链的合成后,用HF将肽链从树脂上脱离下来
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