IMOBILIZAÇÃO DE LACASE A PARTÍCULAS MAGNÉTICAS DE

of 96

Please download to get full document.

View again

All materials on our website are shared by users. If you have any questions about copyright issues, please report us to resolve them. We are always happy to assist you.
PDF
96 pages
0 downs
18 views
Share
Description
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS…
Transcript
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS IMOBILIZAÇÃO DE LACASE A PARTÍCULAS MAGNÉTICAS DE POLISILOXANO-ÁLCOOL POLIVINÍLICO ROZIANA CUNHA CAVALCANTI JORDÃO RECIFE, 2010 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS IMOBILIZAÇÃO DE LACASE A PARTÍCULAS MAGNÉTICAS DE POLISILOXANO-ÁLCOOL POLIVINÍLICO Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, nível Doutorado, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas, na área de Biotecnologia pela Universidade Federal de Pernambuco Doutoranda: Roziana Cunha Cavalcanti Jordão Orientador: Prof. Dr. Luiz Bezerra de Carvalho Júnior RECIFE, 2010 Jordão, Roziana Cunha Cavalcanti Imobilização de lacase a partículas magnéticas de polisiloxano-álcool polivínilico/ Roziana Cunha Cavalcanti Jordão. – Recife: O Autor, 2010. 95 folhas : il., fig., tab. Orientador: Luiz Bezerra de Carvalho Júnior. Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas. Biotecnologia, 2010. Inclui bibliografia e anexos. 1. Lacase (enzima) 2. Proteína 3. Fenóis 4. Álcool I. Título. 572.7 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2010-106 Dedico este trabalho a minha família, aos meus professores, amigos e a todos que de alguma forma contribuíram para meu crescimento pessoal e profissional durante o doutorado. v SUMÁRIO AGRADECIMENTOS .................................................................................................... vi LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... viii LISTA DE TABELAS ..................................................................................................... x LISTA DE ABREVIAÇÕES .......................................................................................... xi RESUMO ....................................................................................................................... xii ABSTRACT .................................................................................................................. xiii 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 15 2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................... 16 2.1 Lacases .................................................................................................................. 16 2.1.1 Origem e distribuição ..................................................................................... 16 2.1.2 Modo de ação das lacases .............................................................................. 17 2.1.3 Propriedades gerais das lacases ...................................................................... 19 2.1.4 Aplicações ...................................................................................................... 20 2.2 Imobilização.......................................................................................................... 21 2.2.1 Considerações gerais ...................................................................................... 21 2.2.2 Imobilização de lacases .................................................................................. 22 2.3. Suporte ................................................................................................................. 24 2.3.1 Considerações gerais ...................................................................................... 24 2.3.2 Partículas magnéticas de polisiloxano álcool polivinílico (mPOS-PVA) ...... 25 3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 28 4 OBJETIVOS ................................................................................................................ 35 4.1. Objetivo geral ...................................................................................................... 35 4.2. Objetivos específicos ........................................................................................... 35 5 ARTIGOS CIENTÍFICOS .......................................................................................... 37 Artigo I – Laccase from Agaricus bisporus immobilized on magnetic polysiloxanepolyvinyl alcohol composite for the oxidation of phenolic mixtures ......................... 37 Artigo II - Immobilization of Trametes versicolor laccase on magnetic polysiloxanepolyvinyl alcohol composite and application in phenolic mixtures oxidation ........... 58 6. CONCLUSÕES .......................................................................................................... 78 7. ANEXOS .................................................................................................................... 79 vi AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus pela vida! A minha amada família pelo apoio, carinho, ensinamentos e sábias lições de vida. Ao Prof. Dr. Luiz Bezerra de Carvalho Junior pela orientação prestada durante a elaboração deste estudo e confiança durante todos os anos de pesquisa no grupo de Imobilização de Biomoléculas. A Luiza Rayanna (Ray) pelo carinho e grande colaboração durante todos os experimentos e redação da tese, especialmente nas companhias, caronas e lanches com sua família, da qual fiz parte temporariamente. Meus sinceros agradecimentos aos amigos e professores Alexandra Salgueiro, Maria Helena, Leonie, Lúcia Fernanda, Sérgio Paiva e Valdemir pelos ensinamentos repassados relacionados à pesquisa bem como relacionados às experiências de vida. A Universidade de Pernambuco e Universidade Católica de Pernambuco pela liberação parcial das atividades. Ao Prof. Dr. José Luiz de Lima Filho, diretor do LIKA, por ceder as instalações para realização de parte da pesquisa; Agradeço a todos que fazem parte do Laboratório de Bioquímica do LIKA-UFPE pela agradável convivência, especialmente a Mariana Cabrera e Vanessa Brustein por toda amizade e apoio constantes; As grandes amigas Lúcia, Janeide e Valéria pelos conselhos e boas risadas. Aos amigos Ucêmicos pela amizade que espero que perdure por muito tempo. Agradeço a Adenilda Eugênia de Lima, secretária do PPGCB pela ajuda constante; vii A todos os funcionários do LIKA pelo apoio técnico; Agradeço ao CNPq pelo suporte financeiro durante o curso deste trabalho; A todos que, de forma direta ou indireta, contribuíram para a realização deste trabalho. viii LISTA DE FIGURAS REVISÃO DA LITERATURA Figura 1 Estrutura tridimensional da lacase de Trametes versicolor. 15 Figura 2 Sítio ativo das lacases. 16 Figura 3 Ciclo catalítico das lacases. 17 Figura 4 Estrutura da matriz híbrida POS-PVA. 25 Figura 5 Reações químicas para preparação da matriz híbrida de POS-PVA 26 ARTIGO I Laccase from Agaricus bisporus immobilized on magnetic polysiloxane-polyvinyl alcohol composite for the oxidation of phenolic mixtures Figure 1 Best immobilization conditions for the laccase concentration (A), time (B) and pH (C) reaction coupling. 45 Figure 2 Optimum pH (A) and pH stability profiles (B) of the soluble and immobilized laccase. 46 Figure 3 Optimum temperature (A) and temperature stability profiles (B) of the soluble and immobilized laccase. 47 Figure 4 Reusability of laccase immobilized on mPOS-PVA. 48 ix ARTIGO II Immobilization of Trametes versicolor laccase on magnetic polysiloxanepolyvinyl alcohol composite and application in phenolic mixtures oxidation Figure 1 Pareto chart for the laccase immobilization. 65 Figure 2 Response surface of the effect of laccase concentration, immobilization pH 66 and their mutual interaction on protein loading. Figure 3 Response surface of the effect of laccase concentration, immobilization pH 67 and their mutual interaction on specific activity. Figure 4 Pareto chart for phenol biotransformation. Figure 5 Response surface plots for transformation of phenolic mixture as a function of: (a) phenol concentration and pH for 32 h; (b) reaction time and phenol 71 concentration at pH 6.0; (c) pH and time of reaction at 1.0 mM of phenol concentration. 70 x LISTA DE TABELAS REVISÃO DA LITERATURA Tabela 1. ARTIGO II Propriedades de lacases de diferentes origens imobilizadas por ligação covalente em suportes insolúveis em água 22 Immobilization of Trametes versicolor laccase on magnetic polysiloxanepolyvinyl alcohol composite and application in phenolic mixtures oxidation Table 1. Experimental design and results according to the CCRD 22. Table 2. ANOVA of protein loading of mPOS-PVA including laccase concentration, immobilization as well as their interactions. 65 Table 3. Experimental design and results according to the CCRD 23. 69 Table 4. ANOVA of phenol transformation using immobilized laccase on mPOS-PVA including pH, phenol concentration and time reaction. 70 64 xi LISTA DE ABREVIAÇÕES ABTS - ácido 2,2´-azino-bis-(3-etilbenzotiazol-6-sulfônico) DEI – Derivado Enzimático Imobilizado EC - Enzyme Commission kDa - quilo Daltons mPOS-PVA - Polissiloxano Álcool Polivinílico Magnetizado POS - Polissiloxano PVA - Álcool Polivinílico SGZ – Siringaldazina xii RESUMO Imobilização de lacase de Trametes versicolor a partículas magnéticas polissiloxano álcool polivinílico (mPOS-PVA) e sua aplicação para a remoção de compostos fenólicos de uma mistura modelo de fenol foram estudados. As partículas de mPOSPVA foram preparadas usando o processo sol-gel e magnetizadas por co-precipitação de íons Fe2+ e Fe3+. As condições de imobilização e de oxidação de fenóis foram investigados. Delineamento composto central rotacional e metodologia de superfície de resposta foram utilizados para avaliar os efeitos de parâmetros de imobilização, como concentração de enzima, pH e tempo de imobilização. A quantidade de lacase imobilizada foi 3,0 mg/g de suporte sob condições otimizadas (50 μg ml -1 de lacase, pH 4,5, 180 min e temperatura de 25◦C). Excesso de proteína imobilizada ao suporte resultou em baixa eficiência do biocatalisador. A lacase imobilizada foi utilizada para a oxidação de uma mistura de cinco compostos fenólicos (fenol, guaiacol, pirogalol, resorcinol e ácido tânico) comumente presentes em efluentes da indústria papeleira. Os compostos fenólicos foram oxidadas pela lacase formando produtos insolúveis, os quais foram removidos do meio de reação por filtração em membrana. Para obter as melhores condições para oxidação de fenol, um delineamento composto central rotacional com diferentes combinações de pH, concentração de fenol e tempo de reação foi realizada. O derivado imobilizado reduziu 65,1% de teor de fenóis totais da solução modelo sob condições ótimas (concentração de fenóis de 1mM, pH 6,0 durante 32h). Os resultados destes experimentos indicam que a metodologia de superfície de resposta foi um método promissor para a otimização de imobilização de proteínas e que lacase imobilizada em mPOS-PVA é eficaz na transformação de misturas de compostos fenólicos. Palvras chave: Imobilização, Álcool polivinílico, Polissiloxano, Lacase, Agaricus bisporus, partículas magnéticas. xiii ABSTRACT Laccase from Trametes versicolor immobilization on magnetic polysiloxane-polyvinyl alcohol particles (mPOS-PVA) and its application for removing phenolic compounds from a phenol model mixture were studied. The mPOS-PVA particles were prepared by using sol-gel process and magnetized by Fe2+ and Fe3+ co-precipitation. The immobilization conditions and of the application phenol oxidation were investigated. Central composite rotatable design and response surface methodology were employed to evaluate the effects of immobilization parameters, such as enzyme concentration, immobilization pH and immobilization time. The amount of immobilized laccase on the mPOS-PVA particles was 3.0 mg/g particles under optimized working conditions (50 μg ml-1 laccase, pH 4.5, 180 min and 25 ◦C), whereas higher loadings gave rise to a less-efficient biocatalyst. The immobilized laccase was used for the oxidation of phenolic compounds (phenol, guaiacol, pyrogallol, resorcinol and tannic acid) chosen among those present in paper-mill industry. Phenol compounds were oxidized by laccase mostly in insoluble products, which were simultaneously removed from reaction medium by filtration through the membrane. To obtain the optimum conditions for the phenol oxidation a central composite rotatable design, with different combinations of pH, phenol concentration and time reaction was performed. Under optimum conditions (phenol concentration 1mM, pH 6.0 during 32h) the immobilized derivative reduced 65.1% of the original phenol content from the model solution. Results of these experiments indicated that response surface methodology is a promising method for optimization of protein immobilization and that immobilized laccase on magnetic polysiloxane-polyvinyl alcohol particles is effective in the transformation of phenolic mixtures. Keywords Immobilization, Polyvinyl alcohol, Polysiloxane, Laccase, Agaricus bisporus, Magnetic particles. Jordão, R.C.C - Imobilização de lacases a partículas magnéticas de Polisiloxano- Álcool Polivinílico 1 INTRODUÇÃO As lacases (benzenediol: oxigênio oxidoredutase, E.C. 1.10.3.2) são membros da família de proteínas multi-cobres, que incluem ascorbato oxidase, ceruloplasmina e bilirrubina oxidases. Estas enzimas catalisam a oxidação de polifenóis e substâncias aromáticas com concomitante redução de oxigênio dissolvido à água (BALDRIAN, 2006). Lacases tem baixa especificidade, podendo agir sobre um amplo espectro de substratos e quando se adiciona ao meio de reação uma molécula mediadora são capazes de degradar compostos aromáticos recalcitrantes com potencial de óxido-redução elevado. Tais características fornecem a esta enzima um grande valor para desenvolvimento de tecnologias ambientalmente seguras nos processos de polpa e papel e na biorremediação de efluentes industriais contendo compostos aromáticos (NILADEVI e PREMA, 2008). Um obstáculo que ainda deve ser superado para aplicação industrial das lacases é o alto custo de produção da enzima, que pode ser minimizado com a pesquisa de novas fontes de lacases, como também a obtenção de derivados enzimáticos imobilizados com boas propriedades operacionais e capazes de preservar sua atividade catalítica em vários ciclos oxidativos consecutivos (DURAN et al. 2002). A imobilização da lacase em suportes sólidos geralmente melhora sua desempenho, pois reduz a susceptibilidade à desnaturação e aumenta sua estabilidade sob condições adversas no ambiente de reação, potencializando sua aplicação em processos industriais. O compósito Polisiloxano-Álcool Polivinílico (POS-PVA) foi descrito para a imobilização de enzimas com obtenção de derivados com boas características catalíticas e estabilidade operacional (NERI et al. 2009). O POS-PVA apresenta grande área de superfície, alta porosidade, estabilidade térmica, óptica e química, configurando boa alternativa para a imobilização de lacases para aplicação na área ambiental (SANTOS et al., 2008; LIMA-BARROS et al., 2002). 15 Jordão, R.C.C - Imobilização de lacases a partículas magnéticas de Polisiloxano- Álcool Polivinílico 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Lacases 2.1.1 Origem e distribuição As lacases (benzenodiol: oxigênio oxidoredutases, E.C. 1.10.3.2) foram descritas inicialmente em 1883, quando extraída da planta Rhus vernicifera e aproximadamente 10 anos depois foram isoladas de fungos (THURSTON, 1994). Lacases são proteínas globulares, com peso molecular de 60 a 100 kDa, apresentando de 10-25 % de carboidrato N-ligado. Estas enzimas são produzidas por fungos (Ascomicetos, Deuteromicetos e Basidiomicetos), bactérias (Azospirillum lipoferum e Bacillus subtilis), insetos (Drosophila melanogaster) e plantas (SUGUMARAN et al., 1992). A grande maioria das lacases descritas na literatura apresenta estrutura monomérica, como a lacase produzida pelo fungo Trametes versicolor (PIONTEK et al., 2002) e outros ocorrem como dímeros que é o caso da lacase de (Agaricus bisporus), conforme sugerido por PERRY et al. (1993). Figura 1. Estrutura de lacase de Trametes versicolor. Os átomos de cobre são mostrados como esferas azuis Fonte: PIONTEK, ANTORINIS e CHOINOWSKI, 2002. 16 Jordão, R.C.C - Imobilização de lacases a partículas magnéticas de Polisiloxano- Álcool Polivinílico 2.1.2 Modo de ação das lacases As lacases são caracterizadas por conter quatro átomos de cobre no seu sítio catalítico (Figura 2). Os átomos de cobre são classificados em três tipos: cobre Tipo 1, responsável pela oxidação do substrato e pela cor azul-esverdeada típica de proteínas multi-cobres (GIARDINA et al., 2010); cobre Tipo 2 e Tipo 3, sendo este último constituído por dois átomos de cobre antiferromagneticamente acoplados (SUNDARAN et al., 1997). Os cobres Tipo 2 e 3 se combinam para formar uma estrutura trinuclear envolvida na ligação com o oxigênio molecular, a qual está coordenada por 8 resíduos de histidina, (COLE, CLARK, e SOLOMON, 1990). Figura 2. Sítio ativo das lacases Fonte: RIVA, 2006. A figura 3 ilustra o ciclo catalítico das lacases, o qual compreende três passos principais: redução do cobre Tipo 1 pelo substrato; transferência eletrônica interna do cobre Tipo 1 para os cobres Tipo 2 e 3; transferência de elétrons do cobre para o O2, 17 Jordão
Related Search
We Need Your Support
Thank you for visiting our website and your interest in our free products and services. We are nonprofit website to share and download documents. To the running of this website, we need your help to support us.

Thanks to everyone for your continued support.

No, Thanks